Выделение и идентификация нетуберкулезных микобактерий у пациентов фтизиатрических учреждений 03. 00. 07 Микробиология - страница 2



Установлено (табл. 1), что жидкая питательная среда (7Н9) более эффективна в выделении микобактерий, чем плотные. Из 227 культур микобактерий, выделенных на трех средах, 204 (89,9%) получены в жидкой питательной среде (как только в ней одной, так и в комбинациях с другими средами). На среде 7Н11 выделены 180 (79,3%), а на Л-Й – 166 (73,1%) культур. Что касается НТМ, то больше всего культур также удалось выделить в жидкой питательной среде 7Н9 – 35 (85,4%), меньше на плотной агаровой 7Н11 – 30 (73,2%), и ещё меньше на среде Л-Й – 27 (65,9%) культур.

Чаще НТМ выделяли на трех средах –18 (43,9%), что достоверно выше, чем при других сочетаниях сред ( p < 0,05), и лишь в единичных случаях только на одной среде: Л-Й – 1 (2,4%); 7Н11 – 2 (4,9%) и 7Н9 – 5 (12,2%), соответственно (табл. 2).

Таблица 2.

^ Частота выделения микобактерий на разных питательных средах

и их комбинациях (абс., %)

Среда

Число выделенных изолятов микобактерий

МАС

M. kansasii

M. xenopi

M. fortuitum

Всего НТМ

Только Л-Й

1

-

-

-

1 (2,4)

Только Миддлбрук 7Н11

1

1

-

-

2 (4,9)

Только Миддлбрук 7Н9

3

1

-

1

5 (12,2)

Л-Й + 7Н11

2

-

-

1

3 (7,3)

Л-Й + 7Н9

2

-

1

2

5 (12,2)

7Н9 + 7Н11

3

2

2

-

7 (17,1)

На всех средах

5

4

3

6

18 (43,9)

ИТОГО

17

8

6

10

41



^ Таблица 3.

Эффективность выделения НТМ на средах Левенштейна-Йенсена

и Миддлбрука 7Н9

^ Вид

микобактерий

Число НТМ выделенных на среде:

Достоверность

различий (р)

Левенштейна-Йенсена

Миддлбрука 7Н9 (BACTEC MGIT 960)

абс.

%

абс.

%

МАС (106)

64

60,4

83

78,3

< 0,02

^ M. kansasii (51)

31

60,8

43

84,3

< 0,01

M. xenopi (42)

35

83,3

39

92,9

< 0,05

^ M. gordonae (16)

10

62,5

13

81,3

< 0,02

M. marinum (6)

4

66,7

5

83,3

> 0,05

^ Всего медлен-норастущие (221)

144

65,2

183

82,8

< 0,05

M. fortuitum (71)

48

67,6

51

71,8

> 0,05

^ M. chelonae (11)

7

63,6

8

72,7

> 0,05

M. flavescens (8)

6

75,0

7

87,5

> 0,05

^ Всего быстро-растущие (90)

61

67,8

66

73,3

> 0,05

^ ВСЕГО НТМ (311)

205

65,9

249

80,1

< 0,05


Дополнительно на значительно большем количестве материала было проведено сравнение эффективности использования двух сред – Левенштейна-Йенсена и Миддлбрука 7Н9, которые постоянно применяют в микробиологической лаборатории МНПЦБТ (табл. 3). Частота выделения всех видов НТМ оказалась также в 1,2 раза выше в жидкой питательной среде, в наибольшей степени это относилось к МАС, M. kansasii, M. xenopi, M. gordonae.

Таблица 4.

^ Сроки выделения культур НТМ на разных питательных средах

^ Вид

микобактерий

Длительность культивирования (дни)

на среде:

Различия в длительности культивиро-вания (коэф-фициент)

Досто-верность

различий (р)

Левенштейна-Йенсена (1)

Миддлбру-ка 7Н11 (2)

Миддлбру-ка 7Н9 (3)

МАС (17)

38,6 ± 3,2

30,1 ± 2,7

22,3 ± 3,4

(1)-(2) – 1,3

(1)-(3) – 1,7

(2)-(3) – 1,4

p1-2 > 0,05

p1-3 < 0,01

p2-3 < 0,05

M. kansasii (8)

30,2 ± 8,6

26,5 ± 4,6

16,1 ± 4,9

(1)-(2) – 1,1

(1)-(3) – 1,9

(2)-(3) – 1,7

p1-2 > 0,05

p1-3 < 0,01

p2-3 < 0,01

M. xenopi (6)

40,4 ± 6,9

30,6 ± 5,1

22,8 ± 5,1

(1)-(2) – 1,3

(1)-(3) – 1,8

(2)-(3) – 1,3

p1-2 > 0,05

p1-3 < 0,01

p2-3 > 0,05

M. fortuitum (10)

38,4 ± 2,1

34,5 ± 4,6

16,8 ± 8,6

(1)-(2) – 1,1

(1)-(3) – 2,3

(2)-(3) – 2,1

p1-2 > 0,05

p1-3 < 0,01

p2-3 < 0,01

^ ВСЕГО (41)

37,2±4,5

30,5±3,9

19,8±5,2

(1)-(2) – 1,2

(1)-(3) – 1,9

(2)-(3) – 1,5

p1-2 > 0,05

p1-3 < 0,01

p2-3 < 0,05


Следует отметить, что обнаружение роста микобактерий в системе BACTEC MGIT 960 (в модифицированной жидкой среде Миддлбрука 7Н9) происходило на 10-20 дней раньше (табл. 4), чем на плотных средах. Среднее время детекции роста на этой среде составило 19,8±5,2 дней, по сравнению с 30,5±3,9 днями на среде 7Н11 и 37,2±4,5 днями на среде Левенштейна-Йенсена (т.е. в 1,5 и 1,9 раз быстрее, соответственно).

Эти данные подтверждены и при расширенном исследовании с использованием только сред Левенштейна-Йенсена и Миддлбрука 7Н9 (табл. 5).


Таблица 5.

^ Длительность культивирования НТМ на средах Левенштейна-Йенсена

и Миддлбрука 7Н9

^ Вид

микобактерий

Длительность культивирования (дни) на среде:

Различия в длительности культивирования (коэф-фициент)

Достоверность

различий (р)

Левенштейна-Йенсена

Миддлбрука 7Н9

МАС (106)

35,9 ± 2,7

18,4 ± 3,0

2,0

< 0,01

^ M. kansasii (51)

28,4 ± 4,2

15,3 ± 3,6

1,9

< 0,01

M. xenopi (42)

36,2 ± 3,9

20,8 ± 3,5

1,7

< 0,01

^ M. gordonae (16)

40,1 ± 4,1

20,3 ± 2,2

2,0

< 0,01

M. marinum (6)

33,3 ± 2,6

20,2 ± 4,9

1,6

< 0,01

^ M. fortuitum (71)

37,8 ± 1,7

16,2 ± 5,1

2,3

< 0,01

M. chelonae (11)

22,2 ± 3,9

13,2 ± 0,9

1,7

< 0,01

M. flavescens (8)

23,4 ± 3,2

14,1 ± 0,3

1,7

< 0,01

^ ВСЕГО (311)

34,5±3,0

17,6±3,5

2,0

< 0,01


Самый высокий процент контаминации посевов наблюдался на среде Л-Й (11,2%), а самый низкий на среде 7Н11 (5,3%), 7,2% образцов было контаминировано в среде 7Н9.

В ходе проведенных исследований выявлено, что недостатком метода выделения микобактерий в жидких питательных средах является невозможность наблюдения за морфологией и хромогенностью колоний.

Преимуществом яичных сред (в частности, Л-Й), является устойчивость к высыханию, а следовательно пригодность для инкубации в течение длительного периода. Однако при росте контаминатов происходит разжижение среды, что приводит к прерыванию инкубации и потере клинически значимых штаммов микобактерий.

Следует также отметить, что агаровая среда Миддлбрука 7Н11, благодаря простому химическому составу менее подвергалась контаминации, а наличие в ее составе гидролизата казеина способствовало росту штаммов, наиболее требовательных к условиям культивирования.

Дополнительное (к среде 7Н9) культивирование на среде 7Н11 и/или Л-Й обеспечивало более полное выделение микобактерий (по данным L.Heifets,1997 до 10% НТМ вырастает только на плотных средах), а использование чашек с агаровой средой 7Н11 позволяет провести первичную идентификацию вида микобактерий по морфологии колоний и выбрать наиболее информативные биохимические тесты для окончательной идентификации, получить чистую культуру в случаях обильного роста контаминантов и обнаружить смешанные культуры микобактерий.

Вместе с тем, следует иметь в виду, что недостатком применения чашек с агаровой средой 7Н11 в условиях централизованных микробиологических лабораторий с большим потоком исследований являются неудобства, связанные с серьезными трудозатратами по инкубированию и просмотру большого количества чашек, однако в пробирочном варианте эта среда может успешно применяться в комплексе выделения микобактерий. Исходя из вышеизложенного, целесообразнее агаровые чашки использовать для субкультивирования изолятов, полученных на плотной яичной или в жидкой питательных средах.

Необходимо подчеркнуть, что ни на одной из изученных питательных сред не удалось выделить из клинических образцов культуры микобактерий в 100% случаев,что является важным доводом для применения их комбинаций.

В итоге проведенных исследований разработан оптимальный микробиологический комплекс методов выделения НТМ: культивирование диагностического материала на модифицированной жидкой питательной среде Миддлбрука 7Н9 (в автоматизированной системе BACTEC MGIT 960) в сочетании с одной из плотных сред.

1.2. Частота обнаружения и видовой состав НТМ, выделенных в Централизованной микробиологической лаборатории МНПЦБТ

Анализ частоты обнаружения НТМ в клиническом материале свидетельствует о существенном увеличении их количества в последние 2 года. Если в 2006 г. выделено 102 (3,0%), в 2007 г. – 111 (3,4%), то в 2008 г. – 253 (6,9%) и за 10 месяцев 2009 года – 268 (8,7%) изолятов НТМ (от общего числа микобактерий) (рис.1).


р2008-2007 < 0,01

р2007-2006 > 0,05

р2009-2008 < 0,05


Рис. 1. Частота обнаружения НТМ за период 2006-2009 гг.


Низкий показатель выделения НТМ в 2006-2007 годы связан с отсутствием оптимальных методических возможностей, поскольку организация данного вида исследований только начиналась. В связи с этим, не все выделенные в лаборатории культуры НТМ идентифицировали до вида, часть из них (полученные в жидкой питательной среде) только дифференцировали от микобактерий туберкулезного комплекса, поэтому при подсчете не учитывали. Начиная с 2008 года, выделение и идентификацию НТМ проводили с использованием разработанного алгоритма, с применением вышеописанного набора питательных сред, молекулярно-генетических методов (ПДРФ, биочипы) и ВЭЖХ, что позволило ускорить процесс идентификации микобактерий и повысить его специфичность. Благодаря этому, за последние годы ряду больных был установлен диагноз микобактериоза (некоторым – вместо туберкулеза) и назначена соответствующая терапия; положительная динамика процесса в большинстве случаев подтвердила правильность диагноза.

При изучении видового спектра выделенных в Центре НТМ было установлено (табл. 6), что две трети из них относились к медленнорастущим (по классификации Runyon) и одна треть к быстрорастущим.

Таблица 6.

^ Частота обнаружения микобактерий при использовании

микробиологических методов

^ Группа микобактерий

Виды

микобактерий

Количество

%

всего

в т.ч.

в ассоциации

M. tuberculosis complex

M. tuberculosis

230

20*

27,3

M. bovis

2




0,2

ВСЕГО

232

20

27,6

Нетуберкулезные микобактерии

Медленнорастущие

MAC

203

16**

24,1

^ M. kansassii

78




9,3

M. xenopi

83




9,9

^ M. gordonae

25




3,0

M. marinum

6




0,7

^ M. scrofulaceum

5




0,6

Прочие****

6




0,7

Всего

406

16

48,3

Быстрорастущие

^ M. fortuitum

169

8***

20,1

M. chelonae

18




2,1

^ M. flavescens

15




1,8

Прочие****

1




0,1

Всего

203

8

24,1

^ ВСЕГО НТМ

609

24

72,4

ИТОГО

841

44

100,0

0466630249416839.html
0466768911095127.html
0466934013692655.html
0467111234274420.html
0467272376762511.html